【案例分析】以mTOR为靶点的抗EV71化合物的设计、合成及生物活性评价

导 读

本文针对目前临床上尚无有效药物的病毒性传染病，为如何快速开发广谱且不耐药的新化合物提供了指导。

参考文献作者及单位

Tianlong Hao, Yuexiang Li, Shiyong Fan, Wei Li, Shixu Wang, Song Li, Ruiyuan Cao，Wu Zhong

军事医学研究院国家应急防控药物工程技术研究中心

参考文献

1. 以mTOR为靶点的抗EV71化合物的设计、合成及生物活性评价

Design, synthesis and pharmacological evaluation of a novel mTOR-targeted anti-EV71 agent. Hao T, Li Y, Fan S, Li W, Wang S, Li S, Cao R, Zhong W. Eur J Med Chem. Apr 24, 2019. IF=4.833

2. 以mTOR为靶点的抗EV71化合物的设计、合成及生物活性评价

郝天龙，军事科学院博士学位论文

案例摘要

目的：以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR为作用靶点，开发全新广谱且不耐药的抗EV71药物。方法：通过分析Torin2和mTOR蛋白之间的相互作用，共设计和合成了三大类新化合物。

结果：经过细胞水平，酶水平、分子水平的生物活性评价，优选体外活性较好5个化合物开展小鼠的药代动力学研究。

结论：根据体外活性、体内药代动力学、在水中溶解度等指标，最终有2个化合物可能是抗EV71治疗的潜在候选化合物。

软件用途

通过ADMET Predictor软件预测了化合物的吸收性质。凡默谷技术部建议还可在设计化合物时，进行化合物的ADMET性质预测，从而筛选出成药性更佳的化合物进行化学合成。

1.  研究背景

手足口病（Hand，Foot and Mouth Disease，HFMD）是一种严重威胁人类特别是儿童生命健康的传染病。根据国家卫生健康委员会报告，截至2015年，我国手足口病累计发病1176万余例，其中死亡3361例，居丙类传染病报告发病数榜首。

引发手足口病的主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）, 它具有高度传染性和变异性。目前临床上尚无有效抑制EV71的抗病毒药物，多数还处于研发阶段，因此研发高效抗EV71的药物日益迫切。

当EV71病毒侵染宿主细胞后，会触发细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR，为病毒的RNA复制和蛋白质合成提供物质基础。如有化合物能抑制宿主细胞mTOR蛋白，则可以阻止病毒RNA复制和蛋白质合成，从而抑制病毒感染。

通过对现有mTOR抑制剂的调研，发现Torin2是一种活性较好的mTOR抑制剂（IC50=0.25nM）,本研究以Torin2作为先导化合物，对其进行结构优化，以期获得活性和成药性都良好的全新结构mTOR抑制剂。

2.   结果与分析

2.1  化学合成

通过分析Torin2和mTOR蛋白之间的相互作用，作者共设计了三大类新化合物，经过计算机虚拟筛选与合成可行性分析后，最终完成了98个新化合物的合成工作，且结构全部经MA，1HNMR进行确认。

2.2  生物活性评价

该研究从细胞水平，酶水平、分子水平对所合成的化合物进行生物活性评价，分别评价了其对RD细胞系肠道病毒71型（EV71）H株的抑制活性、mTOR激酶抑制活性、mTORC1/ mTORC2抑制活性。

2.3  吸收与药代动力学评价

2.3.1  预测吸收性质

对活性较好的5个化合物进行了吸收性质的预测，ADMET Predictor软件的预测结果表明化合物11a, 11b, 11d, 11e, 11m的吸收风险系数Absn_Risk均小于3（风险阈值≤3，说明化合物的吸收较好）。

案例分析人建议：药物设计与结构优化阶段，可通过ADME/Tox预测软件评估所设计化合物的吸收、代谢、分布、排泄及毒性，从而快速淘汰药物代谢性质不佳或有潜在毒性的化合物。我们通过ADMET Predictor软件预测文中的16个的化合物11a-11o，预测结果中有5个化合物的综合风险系数ADMET_Risk大于7，分别是11i，11j，11m，11n，11o，且11m，11n，11o显示有潜在的hERG心脏毒性，建议不合成11m，11n，11o，而在早期设计出更多ADMET性质较佳的新化合物。

其中，整体风险系数ADMET_Risk综合吸收Risk，代谢Risk和毒性Risk的打分规则，对化合物进行全面的ADMET性质打分和成药性评估：对于大部分的药物分子，ADMET_Risk 打分值小于或等于7。

表1：采用ADMET Predictor预测化合物的ADMET性质

红色表示预测结果超出训练集范围，结果可信度不高

2.3.2   溶解度测试

因为大部分抗病毒药物为难溶性药物，即BCS II或IV类化合物，为后期的制剂研发带来了挑战，本研究还测试了体外活性较好的5个化合物在水中的溶解度，范围在0.4-19μg /ml。

案例分析人采用ADMET Predictor预测了这五个化合物和先导化合物Torin2在水中的溶解度，预测结果为Torin2=1μg/ml，5个化合物的水溶性范围在0.4-12μg/ml，与试验结果（0.4-19μg /ml）基本吻合。此外ADMET Predictor还可预测化合物在胃肠道液中的溶解度，分别是：空腹下的胃液S+FaSSGF, 空腹下的肠液S+FaSSIF，餐后状态下的肠液S+FeSSIF。

表2：采用ADMET Predictor预测化合物的在水中和胃肠道中的溶解度

溶解度的单位是mg/ml

2.3.3 体内药代动力学研究

此外，体外活性较好的5个化合物还开展了小鼠的体内药代动力学研究。分别是HTL-6-45=11e, HTL-6-48=11a, HTL-7-01=11b, HTL-7-03=11d, HTL-7-17=11m。其中HTL-6-48(11a)，HTL-7-03(11d)和HTL-7-17(11m)的生物利用度均大于20%, 为有潜力的候选化合物。

3.      总结

本研究针对mTOR激酶，选择Torin2作为先导化合物进行优化设计，共设计和合成出喹啉类，五元环类和Torin2的抗EV71病毒化合物。对已合成的化合物进行体外抗病毒活性测试，结果显示Torin2类衍生物具有较高的体外抑制活性，部分化合物与先导化合物Torin2体外活性相当。通过分子机制研究，Torin2类衍生物属于mTORC1/ mTORC2的双重抑制剂。

接着，作者优选了5个活性优良的化合物开展了水溶性测试和动物的体内PK试验，并进行了初步的构效关系分析，为基于mTOR靶标的新型抗EV71抑制剂的研究提供了基础和方向。