凡默谷技术部

菲并吲哚里西啶生物碱（PAs）是一类具有抗肿瘤、抗炎等活性的天然产物，但其成药性受限于低溶解度、高亲脂性和潜在毒性。本研究通过计算机模拟（ADMET Predictor）结合实验验证，系统评估了44个PAs化合物的吸收（A）、分布（D）、代谢（M）、排泄（E）和毒性（T）特性，筛选出3个候选化合物（CAT、CAT3、PF403），并验证其预测结果的准确性。研究发现：

• 理化性质：PAs普遍具有高亲脂性（logP 2.5–5.85）、低溶解度（<0.1mg/mL）和中高渗透性（MDCK P_app 2.6–11.6×10⁻⁶ cm/s）。

• 分布与代谢：多数PAs易穿透血脑屏障（logBB >0），但为P-gp底物；代谢风险较低（CYP_Risk <2.5），主要经CYP3A4/2D6代谢。

• 毒性风险：部分PAs存在hERG毒性、致癌性风险（TOX_Risk 1–3），需进一步优化。

• 实验验证：CAT3的绝对生物利用度（4.96%）显著低于预测值（61.94%），主因溶解度偏差；血脑屏障穿透预测（logBB ~0.95）与实验（脑/血浆浓度比>1）一致。

1）多参数高通量预测：

• 快速评估44个化合物的关键ADMET参数，包括pKa、logP/logD、溶解度（S+溶解度模型）、渗透性（S+MDCK模型）、血脑屏障渗透性（logBB）、P-gp底物/抑制剂倾向、代谢酶（CYP450/UGT）作用及毒性（hERG、致癌性）。

• 提供综合成药性评分（ADMET_Risk<7.5为优选），辅助筛选出CAT、CAT3、PF403作为实验验证对象。

2） 指导实验设计：

• 预测结果指导了体外实验（如pKa、logD测定）和体内药代动力学研究（如生物利用度、脑分布），缩小实验范围，降低开发成本。

• 通过预测与实验对比，识别关键偏差（如溶解度对生物利用度的影响），优化后续化合物设计。

1）加速早期药物筛选：

• 在药物发现阶段，通过计算机模拟快速淘汰成药性差的化合物（如高TOX_Risk或低溶解度分子），减少不必要的实验投入。

• 提供多维度数据支持（如logBB预测指导CNS药物开发），缩短研发周期。

2）提升预测-实验协同效率：

• 预测与实验数据的一致性（如pKa、logP、血脑屏障分布）验证了ADMET Predictor在理化性质和分布预测中的可靠性。

• 对代谢酶（CYP450）和毒性（hERG）的预测结果可为结构优化提供方向（如避免特定代谢途径或毒性基团）。

3）局限性及改进方向：

• 溶解度预测需结合实验验证（如CAT3的预测溶解度偏高），提示需优化溶解度模型参数或引入更复杂的生理介质模拟(如FaSSIF/FeSSIF)。

• 生物利用度预测偏差（CAT3的Fb预测值过高）反映需整合更全面的吸收模型（如肠渗透性、首过代谢）。

菲并吲哚里西啶生物碱（PAs）是一类小分子天然产物。PAs具有五元环核结构且具有较高的疏水性，这影响了其在消化液中的溶解度和吸收率，导致口服给药时生物利用度较低，抗癌活性减弱。化合物的生物学性质受物理和化学常数的影响，如解离常数（pKa）和油水分配系数（logP和logD）；渗透性、生物利用度、血脑药物浓度分布以及在不同器官中的累积毒性都与解离常数、亲水性和亲脂性有关。

成药性是指化合物具有充分可接受的ADMET特性，良好的成药性能确保药物临床试验的顺利进行。使用传统的实验方法来评估所有化合物的这些特性耗时耗力，为了解大量分子所表现出的成药性，计算机预测成为一种便宜且快速的方法，可以选择成药性最好的化合物作为候选化合物，并且可以淘汰成药性差的化合物。但是，预测结果也可能出现较大偏差，并影响结论的有效性。因此，在进入严格的临床研究之前，需要通过实验验证最佳候选化合物的特性。

本研究旨在对44个PAs化合物的成药性进行深入研究，如pKa，亲脂性，渗透性，溶解度，跨血脑屏障作用，P-糖蛋白（P-gp）转运和绝对生物利用度。使用ADMET Predictor进行了系统性地成药性预测，然后从44个化合物中筛选出3种具有代表性的候选化合物，通过实验验证了预测结果的准确性。

2.1  44个化合物的ADMET性质预测

使用ChemDraw绘制了PAs系列化合物的二维化学结构式；接着将结构式导入ADMET Predictor预测了PAs系列化合物的ADMET性质，包括pKa、亲脂性、渗透性、溶解度、血脑屏障渗透性、P-gp转运和绝对生物利用度；还进一步预测了PAs吸收、代谢和毒性的风险。

2.2 体外实验测定ADMET性质

CAT、CAT3和FP 403这三种化合物为最有希望的候选化合物，开展了体内外实验的测定和预测准确性的评估，包括测定pKa、logP、溶解度、MDCK渗透性、P-gp底物与抑制剂等常规ADME参数，以及研究大鼠口服绝对生物利用度和血脑屏障透过率等。

3.1  44个化合物ADMET性质的预测

预测结果显示44个化合物的的pKa值在4.19和8.92之间。结果显示44个PAs化合物均为高亲脂性化合物，预测的logP值在2.5和5.85之间。44个PAs化合物在MDCK细胞单层模型中的预测渗透性（P_app）在260×10^-7和1159×10^-7cm/s之间（图1H），表明44个PAS经口给药时具有中等至较高的渗透性。44个PAs预测的血脑屏障（BBB）渗透性较高，因此，PAs容易穿透BBB（图1K）。44个PAs中有29种的脑-血分配系数的对数（logBB）>0.7，因此，脑中的浓度将比血液高>5倍；此外，44个PAs中有43种的logBB>0，表明脑中的浓度高于血液中的浓度。预测44个PAs均为P-gp底物，一半的PAs（19/44）是P-gp抑制剂。

ADMET Predictor预测的口服吸收特性，称为吸收风险或Absn_Risk，基于8种理化参数计算，如分子大小和电荷、可旋转键、氢键供体和受体、亲脂性、渗透性和水溶性。通常，吸收风险评分<3.5的分子被认为是潜在的候选分子。44个PAs的Absn_Risk值均为0~3.0，因此，口服给药后PAs可被吸收（图1C）。但有几个影响吸收的风险因素，如较大的分子尺寸、低水溶性和亲脂性较高，在Absn_Code的列中标记为size、K_ow和S_w。预测结果表明CAT3在大鼠体内的吸收率（Fa）和绝对生物利用度（Fb）分别为98.99%和61.94%。

药物代谢特性通过5种主要CYP 450代谢酶组成的Risk模型表征，通常将Risk得分<2.5的化合物视为潜在候选者。44个PAs的CYP_Risk值为0−2.4，因此，经口给药后所有PAs均具有可接受的代谢特性（图1D）。代谢高风险项目分别为化合物在人肝微粒体、CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4中被过高的代谢。

使用TOX_Risk模型表征毒性特性，该模型包括人心脏毒性（hERG）、大鼠急性毒性和慢性大鼠或小鼠研究中的致癌性。通常，TOX_Risk评分<2.0的分子被认为是安全的。44个PAs的TOX_Risk值为1-3.0，36/44个PAs高于阈值（图1E）。PAs的主要风险因素为hERG毒性、小鼠的致癌性TD₅₀（Mouse_TD₅₀，Xm）和致突变性（MUT）。这可能与PAs通过破坏癌细胞DNA结构和干扰DNA功能而具有突出的抗癌活性有关。

通过ADMET_ Risk表征化合物的成药性，不仅包括Absn_Risk、CYP_Risk和TOX_Risk，还包括人血浆蛋白游离分数和人体稳态分布容积。通常，ADMET_Risk评分<7.5被认为是潜在候选化合物。44个PAs的ADMET_Risk值为1-9，44个PAS中有32种的值<7.5，表明大多数PAS具有良好的成药性（图1B）。

综合考虑44个PAs的成药性，3种化合物（CAT、CAT3和PF403）是最有希望的候选化合物（凡默谷小编建议：可使用Pareto optimal selection的功能进行成药性的综合筛选）。因此，在后续实验中对这三种化合物进行了详细研究，以验证预测值的准确性和推动化合物的进一步开发，这三种化合物的ADMET性质预测结果见表1。

3.2 实验测定结果

3.2.1 pKa的测定

紫外分光光度法测定了不同浓度甲醇-水溶液中的p_sK_a+log[H₂O]值，最终推算得到CAT、CAT3、PF403在水溶液中的pKa值为7.91、7.30和7.67。

3.2.2 logP正辛醇和logP环己烷的测定

CAT、CAT3和PF403在正辛醇-水溶液和环己烷-水溶液中的logP测定结果如表2所示（ΔlogP表示logP正辛醇和logP环己烷之间的差异）。CAT、CAT3和PF403在正辛醇中的logP较高，分别为3.68、4.34和3.26；在环己烷中的logP值分别为2.35、2.96和2.07。ΔlogP值均>1.0。

3.2.3 系列pH值下logD的测定

图2显示了CAT、CAT3和PF403在不同pH值下的logD值，CAT、CAT3和PF403在pH 7.4时的logD值分别为2.57、3.86和2.39。

3.2.4 溶解度的测定

CAT、CAT3和PF403在水、SGF和SIF中的溶解度通过将10 mg样品置于200 mL相应溶液中来测试。结果表明，没有一种PAs能完全溶解在任何溶液中。因此，CAT、CAT3和PF403在水、SGF和SIF中是不溶性化合物。

3.2.5 渗透性及P-gp底物/抑制剂的测定

CAT、CAT3和PF403跨MDCK-MDR 1细胞单层的渗透性，结果见表3。在MDCK-MDR 1细胞模型中，CAT、CAT3和PF403在100ng/mL时显示出极低的Papp（AP-BL），分别为0.1272 ± 0.02352×10^-6、0.1139 ± 0.01827×10^-6和0.1880 ± 0.03736× 10^-6cm/s。CAT和CAT3均未显示出外排特征，外排率（ER）分别为1.04和1.09。PF403在体外表现出较强的外排性，ER为2.991。此外，当与维拉帕米孵育时，ER下降至1.56，表明PF403可能是P-gp的底物。

3.2.6 绝对生物利用度的测定

图3显示了以12mg/kg的剂量口服CAT3后和以1 mg/kg的剂量静脉注射CAT3后的血药浓度-时间曲线，并且表4中列出了主要药代动力学参数并由此计算CAT3的绝对生物利用度为4.96%。

3.2.7 血脑屏障渗透性的测定

图4展示了口服给药后不同时间点大鼠血浆和脑组织中CAT3 的浓度，由此计算在1、4和8小时，脑组织和血浆之间的CAT3浓度比分别为0.909、1.927和1.081，对数值（logBB）分别为-0.0414、0.2850和0.0340。因此，CAT3容易穿过BBB，并迅速从血液分布到脑组织，且脑中的CAT3浓度接近或显著高于血浆。

44个PAs化合物的20位氮原子作为主要的电离基团，与邻菲并吲嗪稠合的芳环位于同一位置，具有相似的pKa值。然而，由于取代基的不同，这44个化合物的亲水性和亲脂性差异很大。通过紫外分光光度法测定了3种候选化合物的pKa值，结果表明，测得的pKa值约为7.6，logP值范围为3.26-4.34，与3种化合物的预测值接近，这证明了ADMET Predictor的准确性。

MDCK-MDR 1细胞单层模型的渗透性测量结果显示，CAT、CAT3和PF403的P_app值均小于2×10^-6 cm/s。因此，PAs是低渗透性化合物。使用ADMET Predictor预测的S+MDCK值约为6~8×10^-6cm/s，S+MDCK稍高于实测值。这可能是因为PAs的极高亲脂性使其在体外渗透模型中更容易与细胞膜结合，使得测量的P_app低于预测值（凡默谷小编建议：由于这三个化合物都具有低外排比的特性，建议使用ADMET Predictor 12.0版本的S+MDCK_LE模型进行预测，可以得到与实验结果较为一致的结果）。

预测结果表明，所有PAs化合物均为P-gp底物。此外，44个PAs中有19种是P-gp抑制剂，包括CAT和CAT3，但不包括PF403。CAT和CAT3是P-gp的底物和抑制剂，而PF 403只是P-gp的底物而不是抑制剂，这也解释了PF403容易被P-gp外排并且具有较高ER的原因。对于PAs类化合物，当同时分析是否为P-gp底物和是否为P-gp抑制剂这两个指标时，该化合物的渗透性预测准确性会更好。

此外，血脑药物浓度比对于靶向脑组织治疗CNS疾病的药物具有重要意义。本研究的结果表明，在大鼠的组织分布实验中，CAT3的脑浓度显著高于血浆。44个PAs的logBB预测结果也证实了PAs容易穿透BBB。

CAT3的绝对生物利用度的预测结果（61.94%）高于实验测定结果（4.96%），这可能是因为CAT3溶解度预测的偏差，体外实验测定CAT3不溶于水和其他生理介质，属于难溶性药物，所以溶解度会显著影响CAT3在体内的生物利用度（凡默谷小编：ADMET Predictor 12.0版本中，采用平均的单pH溶解度与平均渗透性预测的CAT3大鼠F为19.73%；采用预测域下限的单pH溶解度与平均渗透性预测的CAT3大鼠F为3.38%）。

ADMET Predictor预测结果与CAT3实验结果的比较已被报道，表明ADMET Predictor可以正确预测CAT3被CYP1A2、3A4、2B6、2C8和2D6酶代谢，但预测CYP2C9和2C19不正确。ADMET Predictor也可以正确预测UGT1A1，但错误预测UGT1A3和1A9。总的来说，预测结果的准确性较高，可以作为筛选其他PAs化合物的参考。

PAs类化合物具有低溶解度和低渗透性，属于BCS IV类化合物，绝对生物利用度低。但是这些化合物具有高度的亲脂性，口服后易快速进入脑内。在成药性筛选阶段，ADMET Predictor可以快速准确地预测PAs的理化和生物学性质，预测结果适合作为候选化合物发现阶段的参考。

Drug-like properties of serial phenanthroindolizidine alkaloid compounds: ADMET characteristic prediction and validation

Hongliang Wang, Jinping Hu, Ming Ji, Rubing Wang, Jing Jin, Jun Ye, Haijing Zhang, Lin Li, Renyun Wang, Yanfang Yang, Yue Gao, Xuejun Xia, Xueqing Xu, Lili Gao and Yuling Liu. Acta Materia Medica. 2024, Volume 3, Issue 1, p. 88-104